Lange galt die Lichtmikroskopie als ausgereizt und für höhere Auflösungen ungeeignet: Strukturen, die weniger als 200 Nanometer auseinander liegen, so die seit rund 130 Jahren unangefochtene Lehrmeinung, könnten unter dem Lichtmikroskop nicht scharf voneinander getrennt werden. Ein im Lichtstrahl fluoreszierender Marker erscheint daher als unscharfer Fleck, sobald er die kritische Größe unterschreitet.
Stefan Hell und die STED-Mikroskopie
Doch Stefan Hell und seine Mitarbeiter am Max-Planck-Institut für biophysikalische Chemie ließen sich davon nicht abschrecken: Sie suchten nach einer Möglichkeit, um einzelne Moleküle, beispielsweise Proteine, mittels Fluoreszenzmarkern in den Feinstrukturen des Gewebes sichtbar zu machen. Das Elektronenmikroskop – das ja eine höhere Auflösung liefert – kam dafür nicht in Frage, da es nur wenige Mikrometer tief in eine Probe eindringt und auch Fluoreszenz nicht sichtbar machen kann. Also musste die Auflösung der Lichtmikroskopie erhöht werden – trotz der scheinbaren Unmöglichkeit.
Mit der Stimulated Emission Depletion Mikroskopie (STED) gelang den Wissenschaftlern tatsächlich der Durchbruch. Dabei verwendeten sie zusätzlich zum energiereichen Lichtstrahl, der für die Anregung der Fluoreszenzmarker sorgt, einen zweiten Strahl, der die angeregten Fluoreszenzmarker wieder abregt, bevor sie Fluoreszenzlicht emittieren. Der Trick, um die höhere Auflösung zu erreichen, bestand nun darin, diesen zweiten, eigentlichen STED-Strahl ringförmig über den ersten zu legen. Dadurch wurden vor allem Marker aus dem Außenbereich des ersten Strahls abgeregt und die Fläche des Fluoreszenzflecks verkleinerte sich. Eine Auflösung von unter 20 Nanometern erreichten die Forscher auf diese Weise – und unterboten damit die vermeintliche Auflösungsgrenze der Lichtmikroskopie um mehr als das Zehnfache.
Mit dem STED Mikroskop konnten Hell und sein Team im April 2006 erstmals das Geschehen an neuronalen Synapsen, den Kontaktstellen zwischen zwei Nervenzellen, genauer untersuchen und bewiesen damit, dass die Abbesche Auflösungsgrenze “ausgetrickst” werden kann.
William Moerner und Eric Betzig: Überlagertes Leuchten
Während Hell an seiner STED-Mikroskopie arbeitete, beschäftigte sich William Moerner an der University of California in San Diego mit einem grün fluoreszierenden Quallenprotein. Dieses Protein gibt grünes Licht ab, wenn es mit blauem Licht der Wellenlänge von 405 Nanometern bestrahlt wird, wie der Forscher feststellte. Durch Versuche mit Proteinen in Gel stellte Moerner fest, dass sich das Fluoreszieren der einzelnen Moleküle gezielt an- und abschalten und per Lichtmikroskop beobachten ließ – solange die Proteinmoleküle weiter als die Abbesche Auflösungsgrenze von 200 Nanometern voneinander entfernt waren. Er selbst schaffte es damit nicht, die magische Grenze zu unterschreiten, lieferte aber dafür eine wichtige Voraussetzung:
